Evaluación de la seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes SARS-CoV-2 (Información)


¿Por qué participar?

En el momento actual no sabemos los anticuerpos que detectamos frente a SARS-CoV-2 confieren inmunidad (protección) frente a posteriores exposiciones a este virus. Este estudio está abierto a todos los profesionales sanitarios del Sector Sanitario Zaragoza III (Atención Primaria y Especializada) que hayan optado por realizarse la prueba de detección de SARS-CoV-2 cuyo resultado sea positivo.

 

¿Cuál es el objeto de este estudio?

Conocer con qué frecuencia las personas que han estado en contacto con el SARS-CoV 2 y han desarrollado anticuerpos específicos, éstos tienen capacidad neutralizante (son protectores) frente a este virus.

 

¿Qué tengo que hacer si decido participar?

Autorizar la determinación de anticuerpos IgG frente a la proteína Spike1 y el RBD del SARS-CoV-2 en la muestra de sangre que se obtuvo en el contexto del análisis de IgG para SARS-CoV-2.

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¿Qué riesgos o molestias adicionales supone?

Se va a trabajar sobre la muestra extraída y no se le va a realizar ningún procedimiento adicional.

 

¿Obtendré algún beneficio por mi participación?

Podrá saber si en el momento de la extracción se han identificado anticuerpos con actividad neutralizante (protectores) frente a SARS-CoV-2. No obstante no se puede garantizar su duración ni por tanto su estado inmune, por lo que tendrá que seguir tomando las medidas / precauciones recomendadas en el ámbito laboral y personal / familiar.  No hay compensación económica por su participación.

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Si desea más información sobre el estudio siga leyendo

Justificación

  • Las personas que superan la infección por SARS-CoV-2 desarrollan anticuerpos frente a distintas dianas/antígenos del virus que, con frecuencia, son identificables el suero.
  • La capacidad neutralizante de los anticuerpos generados por cada persona que ha desarrollado una respuesta humoral frente a SARS-CoV-2 se desconoce. Se cree que los anticuerpos dirigidos contra la zona de SARS-CoV-2 responsable de la entrada del virus en la célula (proteína Spike-1 y el domino de unión al receptor ACE2 -RBD-)
  • Las técnicas serológicas disponibles frente a SARS-CoV-2 han sido validadas con propósitos diagnósticos pero no para anticipar la capacidad neutralizante de los anticuerpos identificados.
  • Saber si los anticuerpos detectados frente a SARS-CoV-2 son neutralizantes podría ayudar a predecir mejor la protección/inmunidad de dicha persona frente a posteriores contactos con el virus, así como identificar donantes de plasma hiperimune.
  • Una vez superado el pico de la primera onda pandémica el Hospital Clínico Universitario de Zaragoza ofrece los profesionales que lo deseen la realización de una prueba de detección de anticuerpos (serología) frente a SARS-CoV-2.
  •  En este contexto, el Grupo de Investigación Clínica en Enfemedades Infecciosas  y el Grupo de Investigación Inmunoterapia, Inflamación y Cáncer (I2C) del IIS Aragón ha .diseñado un proyecto de investigación que resumimos a continuación.

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Objetivo

  • Conocer la frecuencia de anticuerpos potencialmente neutralizantes frente a SARS-CoV-2 entre el personal sanitario del Hospital Clínico Universitario y del sector Zaragoza III tras el pico de la primera oleada de la pandemia Covid-19.

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Métodos

Diseño y ámbito

  • Estudio de seroprevalencia de anticuerpos neutralizantes frente a SARS-CoV-2 entre profesionales sanitarios de Atención Primaria y Atención Hospitalaria del Sector Sanitario Zaragoza III tras el pico de la primera oleada de la pandemia Covid-19

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Población, tamaño muestral y reclutamiento

  • La población del estudio está compuesta por los trabajadores de Atención Primaria y Atención Especializada del sector sanitario Zaragoza III que tengan serología positiva para IgG de SARS-CoV-2.
  • Aquellos profesionales con serología positiva para IgG de SARS-CoV-2 se les invitará a participar en el estudio, previa firma del consentimiento informado.
  • Sobre las muestras de sangre de los trabajadores que deseen participar en el estudio y que fueron obtenidas para la determinación de anticuerpos IgG frente a SARS-CoV-2 se realizarán los estudios experimentales de detección de anticuerpos que se detallan en la sección determinantes de laboratorio.

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Determinaciones de laboratorio

Diseño, puesta a punto y determinación de un ELISA específico frente a la proteína SARS-CoV-2 Spike 1 y el dominio de unión al receptor ACE2 (RBD)

  • De entre los trabajadores con anticuerpos frente a SARS-CoV-2 identificados mediante ELISA comercial se determinará la presencia de anticuerpos frente a la proteína SARS-CoV-2 Spike 1 y el RBD mediante ELISA diseñado y puesto a punto por el equipo del Dr. Julián Pardo.
  • La proteína de SARS-CoV-2 Spike-1 y el domino de unión al receptor ACE2 (RBD) se van a producir mediante transfección de los cDNA correspondientes (Cedidos por el equipo del Dr. Krammer, USA) en células humanas 293T mediante electroporación.
  • Se llevarán a cabo los análisis de expresión mediante electroforesis y se seleccionarán las células con mayor expresión. Las proteínas se purificaran mediante cromatografía de afinidad en níquel y su pureza se analizará mediante electroforesis y tinción con plata.
  • Se desarrollará ELISA indirecto para determinar la concentración de IgG, IgA o IgM en plasma. Para ello se utiliza un protocolo convencional inmovilizando Spike1 o RBD en placas de 96, seguido de bloqueo con albúmina e incubación con diluciones seriadas de los plasmas de pacientes o controles.
  • Seguidamente se usarán anticuerpos frente a IgG, IgA o IgM humana unidos a biotina y estreptavidina unidad a HRP. Tras incubar con un sustrato de HRP se parará la reacción con acido sulfúrica 1M, lo cual también inactiva los posibles virus y se determina la absorbancia en un espectrofotómetro de placas. Como controles negativos usaremos plasma de donantes sanos de hace más de 5 años (almacenados por el grupo de Julián Pardo) .
  • La concentración de anticuerpo específico anti-SARS-CoV2 se calculará teniendo en cuenta la concentración total de IgG, IgM o IgA calculada mediante ELISA.

 

Ensayo de neutralización.

  • Los ensayos de neutralización se llevaran a cabo utilizando pseudovirus generados in vitro utilizando un vector lentiviral y el cDNA de spike junto con luciferasa. Este tipo de virus requiere de instalaciones Bsl-2 . (Crawdford et al, 2020. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 Spike protein for neutralization assays. https://doi.org/10.1101/2020.04.20.051219)
  • En concreto se generan los lentivirus mediante transfección de células 293T de los siguientes cDNA:
  • pHAGE-CMV-Luc2-IRES-ZsGreen-W
  • HDM_IDTSpike_fixK,
  • HDM_Hgpm2, tat1b,_Rev1b.
  • Tras 72 h se recogerá el sobrenadante que contiene lentivirus, que expresan la luciferasa y la proteína fluorescente ZSGreen y que además expresan Spike en su superficie y se congelarán.
  • Para los ensayos de neutralización se incubarán los lentivirus con células 293T en presencia o no de diferentes diluciones de los plasmas. Tras 6 horas, se analizará la expresión de luciferasa en las células mediante un espectrofotómetro de placas con luminiscencia.
  • Como controles negativos usaremos plasma de donantes sanos de hace más de 5 años (almacenados por el grupo de Julian Pardo) y las proteína RBD y spike 1 solubles.
  • La concentración de anticuerpos neutralizantes se calculará mediante la determinación de IC50 (concentración que inhibe la entrada del 50% del virus respecto al control sin plasma) teniendo en cuenta la concentración total de IgG, IgM o IgA y la concentración de IgG, IgM o IgA frente a Spike1 o RBD calculada mediante ELISA tal y como se describe arriba.  Como controles negativos usaremos plasma de donantes sanos de hace más de 5 años (almacenados por el grupo de Julián Pardo) .

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